Pfu DNA Polimerase
Pfu Pol é a escolha ideal para aplicações onde a eficiência na amplificação e elevada fidelidade são necessárias. A enzima catalisa a polimerização de nucleotídeos na fita dupla de DNA na direção 5' → 3' mas não possui ativididade 5' → 3' exonuclease. Sua atividade proofreading 3 '→ 5' resulta em elevada fidelidade na síntese de DNA comparada com a Taq DNA Polimerase. Pfu Pol gera fragmento de PCR não coesivos (blunt). A enzima é altamente purificada e livre de DNA bacteriano.
Definição de unidade
Uma unidade é definida como a quantidade de enzima requerida para catalisar a incorporação de 10 nmoles de dNTPs em uma forma ácido-insolúvel em 30 minutos a 70 °C.
CONTEÚDO
Pfu Pol (blue cap)
2.5 unidades/µL Pfu DNA polimerase em 20 mM Tris-HCl, 100 mM KCl, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0.5% Tween-20, 0.5% Nonidet P-40, 50% glicerol (v/v), pH 8.0 (25 °C)
Pfu Reaction Buffer complete 10x (red cap)
200 mM Tris-HCl, 100 mM KCl, 100 mM (NH4)2SO4, 20 mM MgSO4, 1% *(v/v) Triton X-100, 1 mg/mL BSA, pH 8.8 (25 °C)
PROTOCOLO
Apenas para uso in vitro!
Ensaio recomendado: 50 µL
Volume | [ final ] | Componente |
5 µL | 1 X | 10x Pfu Reaction Buffer complete (red cap) |
1 µL | 200 µM | 10 mM dNTPs |
1 µL | 0.2 µM | 10 µM Oligonucleotídeo senso |
1 µL | 0.2 µM | 10 µM Oligonucleotídeo antisenso |
variável | 50 pg - 1 µg | DNA molde |
0.5 - 2 µL | 1.25 - 5 unidades | Pfu Pol (blue cap) |
q.s.p 50 µL | Água grau PCR | |
Condições de ciclagem recomendadas
Denaturação inicial | 95 °C | 1-3 min | 1 X |
Denaturação | 95 °C | 15-30 s | 25-30 X |
Hibridização1 | 45-70 °C | 15-30 s | |
Elongação2 | 72 °C | 1 min/kb | |
Elongação final | 72 °C | 1-2 min/kb | 1 X |
1 A temperatura de hibridização depende da temperatura denaturação (melting) do oligonucleotídeo empregado.
2 O tempo de elongação depende do tamanho do fragmento que se pretende amplificar. Recomenda-se 1 min por kb.
TRANSPORTE E ARMAZENAGEM
Transportado em blue ice
Armazenada à -20 °C.
DOCUMENTOS
MANUAIS E PROTOCOLOS
- Neutralization Buffer (adicionar RNAse A antes do uso e armazenar à 4°C);
- RNase A (armazenar à -20°C);
- Activation Buffer;
- Washing Buffer (adicionar Etanol 96-99%, conforme indicação);
- Elution Buffer;
- Binding Columns;
- 2 mL Collection Tubes.
Temperatura ambiente (exceto RNAse – armazenada à -20°C)
Manual 2
Manual 3