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Screening - Thermofluor Screens


Os kits de Thermofluor da Jena Bioscience, JBScreen Thermofluor FUNDAMENT e JBScreen Thermofluor SPECIFIC permitem a identificação de condições tamponantes nas quais o alvo proteico torna-se mais estável, fator fundamental para as etapas de purificação, caracterização e cristalização.

A sobreposição não desejável de variáveis interdependentes é evitada pela categorização dos kits em:

  1. FUNDAMENT - Fatores fundamentais que influenciam a molécula proteica como um todo (pH e força iônica).
  2. SPECIFIC - Fatores que promovem alterações energéticas em pontos específicos (hot spots) da proteína (Substratos e análofos, cátions, ânions,...).

A estabilidade térmica da proteína é monitora pelo seu Tm (melting temperature), determinado em ensaios de deslocamento térmico (formato de placa de 96 poços), onde monitora-se o desenovelamento proteico na presença de sonda fluorescente. Quanto maior o Tm maior da proteína, maior será a termoestabilidade da proteína naquele ambiente específico.

Os kits JBScreen Thermofluor FUNDAMENT e SPECIFIC estão disponíveis em placas contendo 0,5 mL de cada solução, permitindo um manejo facilitado.

 

Exemplo: Efeitos de estabilização sobre α-quimiotripsinogênio A e sua direta correlação com a cristalização

 

α-Quimiotripsinogênio A foi avaliado frente aos kits JBScreen Thermofluor FUNDAMENT e SPECIFIC.

Condições estabilizantes (alta força iônica, pH neutro, CaCl2 & FeCl3 foram combinados sem otimizações posteriores. Triagem de cristalização foi realizada com:

  • sem adição de íon específico
  • com 20 mM CaCl2
  • com 10 mM FeCl3


O crescimento dos cristais foi promovido pela estabilização com íons CaCl2 e FeCl3 identificados com JBScreen Thermofluor SPECIFIC.


"Protein Crystallization: Simply grab the needle from the haystack"

Palestra na HEC19 (Warberg - 2016)

 

 

 

Referências

  • REINHARD, L.; MAYERHOFER, H.; et al. Optimization of protein buffer cocktails using Thermofluor. Acta Crystallographica Section F: Structural Biology and Crystallization Communications, v. 69, n. 2, p. 209–214, 2013
  • NIESEN, F.H.; BERGLUND, H.; et al. The use of differential scanning fluorimetry to detect ligand interactions that promote protein stability. Nature protocols, v. 2, n. 9, p. 2212–21, 2007
  • ERICSSON, U.B.; HALLBERG, B.M.; et al. Thermofluor-based high-throughput stability optimization of proteins for structural studies. Analytical Biochemistry, v. 357, n. 2, p. 289–298, 2006.