Screening - Thermofluor Screens
Os kits de Thermofluor da Jena Bioscience, JBScreen Thermofluor FUNDAMENT e JBScreen Thermofluor SPECIFIC permitem a identificação de condições tamponantes nas quais o alvo proteico torna-se mais estável, fator fundamental para as etapas de purificação, caracterização e cristalização.
A sobreposição não desejável de variáveis interdependentes é evitada pela categorização dos kits em:
- FUNDAMENT - Fatores fundamentais que influenciam a molécula proteica como um todo (pH e força iônica).
- SPECIFIC - Fatores que promovem alterações energéticas em pontos específicos (hot spots) da proteína (Substratos e análofos, cátions, ânions,...).
A estabilidade térmica da proteína é monitora pelo seu Tm (melting temperature), determinado em ensaios de deslocamento térmico (formato de placa de 96 poços), onde monitora-se o desenovelamento proteico na presença de sonda fluorescente. Quanto maior o Tm maior da proteína, maior será a termoestabilidade da proteína naquele ambiente específico.
Os kits JBScreen Thermofluor FUNDAMENT e SPECIFIC estão disponíveis em placas contendo 0,5 mL de cada solução, permitindo um manejo facilitado.
Exemplo: Efeitos de estabilização sobre α-quimiotripsinogênio A e sua direta correlação com a cristalização
α-Quimiotripsinogênio A foi avaliado frente aos kits JBScreen Thermofluor FUNDAMENT e SPECIFIC.
Condições estabilizantes (alta força iônica, pH neutro, CaCl2 & FeCl3 foram combinados sem otimizações posteriores. Triagem de cristalização foi realizada com:
- sem adição de íon específico
- com 20 mM CaCl2
- com 10 mM FeCl3
O crescimento dos cristais foi promovido pela estabilização com íons CaCl2 e FeCl3 identificados com JBScreen Thermofluor SPECIFIC.
"Protein Crystallization: Simply grab the needle from the haystack"
Palestra na HEC19 (Warberg - 2016)
Referências
- REINHARD, L.; MAYERHOFER, H.; et al. Optimization of protein buffer cocktails using Thermofluor. Acta Crystallographica Section F: Structural Biology and Crystallization Communications, v. 69, n. 2, p. 209–214, 2013
- NIESEN, F.H.; BERGLUND, H.; et al. The use of differential scanning fluorimetry to detect ligand interactions that promote protein stability. Nature protocols, v. 2, n. 9, p. 2212–21, 2007
- ERICSSON, U.B.; HALLBERG, B.M.; et al. Thermofluor-based high-throughput stability optimization of proteins for structural studies. Analytical Biochemistry, v. 357, n. 2, p. 289–298, 2006.
