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Enzimas de restrição

A Cellco oferece a linha completa de enzimas de restrição da Jena Bioscience onde todas as enzimas tem capacidade de clivagem em um sistema único de tampão, facilitando a sua estratégia de clonagem e economizando seu tempo:

- 100% atividade em um único tampão universal

- clivagem completa em apenas 5 a 10 min para as enzimas JBSpeed

- validade mínima de 24 meses

 

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Enzimas de restrição Jena Bioscience

Enzimas de restrição Cellco

  

Informações Gerais e Controle de Qualidade

Definição de Unidade

Uma unidade de atividade de endonuclease de restrição é definida como a quantidade de enzima necessária para a completa digestão de 1 µg de DNA substrato em um volume de 50 µL em 60 minutos, nas condições experimentais ótimas determinadas para cada enzima.

Determinação da atividade das endonucleases de restrição

Ensaios de atividade catalítica para as endonucleases são realizados pela adição de diferentes diluição da enzima em meio reacional tamponado contendo 1 µg de DNA substrato. Após 60 minutos de incubação na temperatura apropriada, a reação de digestão é parada e as amostras de DNA são visualizadas através de eletroforese em gel de agarose corado com brometo de etídio. A amostra mais diluída da enzima capaz de promover a digestão completa é empregada para o cálculo de unidades/µL.

Controle de qualidade

Os resultados de todos os ensaios de qualidade são reportados nas Especificações Técnicas fornecidas com cada enzima

Ensaio de digestão excessivo

O ensaio de digestão excessivo é empregado como uma determinação qualitativa da pureza da enzima endonuclease de restrição e ausência de DNAses não-específicas. Neste tipo de ensaio, quantidades crescentes de endonuclease (tipicamente 10, 20, 30, 40, 50 unidades) são adicionadas a tubos contendo 1 µg de DNA. Após 20 horas de incubação nas condições recomendadas, o máximo número de unidades capaz de fornecer um padrão de bandas limpo e definido é determinado por eletroforese em gel de agarose. Para passar neste teste de qualidade, a enzima deve produzir um padrão de bandas inalterado nas condições de excesso 600x (unidades x horas) comparável ao padrão de bandas com excesso de 2x. Se a enzima apresenta atividade star em concentrações menores que 600x, as especificações técnicas do produto detalharão qual concentração não haverá atividade star.

Ensaio para endonucleases não-específicas

Para determinar a presença de contaminação por endonuclease não-específica, cada enzima endonuclease de restrição é incubada com plasmídeo superespiralado, o qual não possui sítio de reconhecimento para enzima avaliada. Um corte/quebra não específico em uma das fitas do DNA RF I, o converte para a forma RF II (circular relaxado). Quantidades crescentes de enzima (tipicamente 10, 20, 30, 40, 50 unidades) são adicionadas a tubos contendo 1 µg de DNA superespiralado RF I (superespiralado). Após 20 horas de incubação nas condições de ensaio recomendadas, as duas formas são distinguidas por eletroforese em gel de agarose e o percentual de conversão entre as formas RF I e RF II é determinado.

Ensaio de Ligação e Re-Digestão

O ensaio de ligação é empregado para determinar a pureza funcional do DNA após a digestão com a enzima endonuclease de restrição. O DNA substrato é completamente digerido com uma concentração da endonuclease de restrição, em excesso de 10 e 50 vezes, no tampão adequado, e posteriormente ligada com T4 DNA Ligase e redigerida com a mesma enzima. Os DNAs cortados, ligados e recortados são analizados por eletroforese em gel de agarose. Um padrão de bandas normal indica que as extremidades 5' e 3' estão intactas, além da ausência de contaminação por nucleases ou fosfatases.

Estabilidade

Todas as endonucleases de restrição da Jena Bioscience são revalidadas a cada 4-6 meses. Este procedimento permite assegurar completa atividade enzimática e excelente performance para cada enzima enviada. Em consequência dos resultados excelentes obtidos, o prazo de validade da maioria das enzimas Jena Bioscience é de 24 meses.

 

Para maiores informações suporte@cellco.com.br

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