
T7 RNA Polimerase
T7 RNA polimerase é uma RNA polimerase dependente de DNA que catalisa a síntese de RNA a partir de uma sequência promotora de T7. A enzima garante a transcrição eficiente de moldes de DNA contendo um promotor de T7.
Definição de unidade
Uma unidade é definida como a quantidade de enzima necessária para incorporar 1 nmol de AMP em um polinucleotídeo em 60 minutos a 37 °C.
Aplicações:
- Síntese de RNA in vitro
- Síntese de sondas de RNA
- Geração de molde de RNA para tradução in vitro
- Estudo de RNAi
Molde de DNA
Em geral, qualquer DNA (plasmídeo linearizado, produto de PCR) contendo um promotor T7 pode ser usado como molde para T7 RNA polimerase.
Sequencia mínima para transcrição eficiente: 5’ – TAATACGACTCACTATAGGGAGA...- 3’
CONTEÚDO
- T7 RNA Polimerase (tampa vermelha)
(200 unidades/µL em 50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 5 mM DTT, 0,1 mg/mL BSA, 0,03% detergente ELUGENT, 50% glicerol (v/v), pH 8,0 (25 °C)
- 5X T7 Reaction Buffer (tampa verde)
(200 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 30 mM MgCl2, 50 mM DTT e 10 mM espermidina)
FORMA
Líquido
CONCENTRAÇÃO
200 unidades/µL
PROTOCOLO
Apenas para uso in vitro!
1. Preparação do ensaio de RT-PCR
Adicione os seguintes componentes em um microtubo livre de nuclease e em seguida vortexar gentilmente.
Componente | [ estoque ] | [ final ] | Reação 20 µL | Reação 50 µL |
T7 Reaction Buffer | 5 X | 1 X | 4 µL | 10 µL |
NTP mix | 10 mM cada | 500 µM cada | 1 µL | 2,5 µL |
Inibidor de RNAse1 | 40 unidades/µL | 1 unidades/µL | 0,2 µL | 0,5 µL |
Molde de DNA com promotor T7 | 10-500 ng | 10-1.000 ng | ||
T7 RNA Polimerase | 200 unidades/µL | 2 unidades/µL | 0,2 µL | 0,5 µL |
Água nuclease-free | qsp 20 µL | qsp 50 µL | ||
1Adicionar 10-20 unidades de inibidor de RNase por reação é recomendado e pode ser essencial quando a quantidade inicial de RNA é baixa.
2. Incubação
Incubar a reação a 37 °C por 30 min.
Nota: Incubação a 42 °C pode aumentar o rendimento em até 10%. Para baixas quantidades de molde de DNA (<100ng) tempo de incubação de até 60 minutos é recomendado.
3. Tratamento com DNase opcional
Adicionar 1 unidade de DNase RNase-free a reação e incubar a 37 °C por 15 min para remoção do molde de DNA.
TRANSPORTE E ARMAZENAGEM
Transportado em blue ice
Armazenar à -20 °C. Evite ciclos de congelamento/descongelamento.
DOCUMENTOS
MANUAIS E PROTOCOLOS
- Neutralization Buffer (adicionar RNAse A antes do uso e armazenar à 4°C);
- RNase A (armazenar à -20°C);
- Activation Buffer;
- Washing Buffer (adicionar Etanol 96-99%, conforme indicação);
- Elution Buffer;
- Binding Columns;
- 2 mL Collection Tubes.
Temperatura ambiente (exceto RNAse – armazenada à -20°C)
Manual 2
Manual 3