qPCR MultiplexMaster with lowROX
qPCR MultiplexMaster com lowROX foi concebido para análises quantitativas em tempo real de amostras de DNA utilizando sondas fluorescentes duplamente marcadas, p. TaqMan®, Beacons Moleculares ou sondas FRET. O master mix é especialmente otimizado para ensaios multiplex com ≥4 sequências-alvo em um único tubo. O sistema supera limitações de multiplex de sondas de qPCR convencionais, combinando uma robustez acima da média para uma multiplicidade de inibidores de PCR conhecidos com uma excelente sensibilidade para amplificação a partir de baixas quantidades de DNA molde. O master mix 2x concentrado contém todos os reagentes necessários para qPCR (exceto molde e conjuntos de oligonucleotídeos/ sondas) incluindo uma polimerase HotStart altamente processiva e dNTPs ultra-puros. O mix proporciona um início por alta temperatura extremamente rigoroso permitindo a montagem da reação e armazenamento temporário à temperatura ambiente antes da PCR. A química da reação do mix é otimizada para instrumentos de PCR de bloco, compatíveis com a avaliação do sinal ROX.
Corante de referência ROX
O qPCR MultiplexMaster com lowROX contém corante de referência passivo ROX na concentração final de 500 nM no ensaio. O corante não faz parte da reação de PCR, mas permite normalizar a variação de sinal não relacionada com a PCR e proporciona uma linha de base em reações multiplex.
Propriedades espectroscópicas
Excitação máxima: λex = 576 nm;
Emissão máxima: λem = 601 nm;
Sondas de DNA duplamente marcadas
A tecnologia de PCR em tempo real baseada em sondas de DNA duplamente marcada fornece um sistema de PCR altamente sensível e altamente específico com capacidade multiplex. Para a amplificação de cada sequência alvo é necessário um conjunto de dois oligonucleotideos e uma sonda de DNA fluorescente que hibridiza com uma parte interna do amplificado. A sequência da sonda de DNA marcada duplamente deve evitar a formação de estrutura secundária e a formação de dímeros de oligonucleotideos.
CONTEÚDO
- qPCR MultiplexMaster com lowROX (tampa vermelha)
(qPCR Pol, dATP, dCTP, dGTP, dUTP, 100 nM ROX, tampão de reação contendo KCl, (NH4)2SO4, MgCl2 e estabilizantes)
- Água grau-PCR (tampa branca)
FORMA
Líquido
CONCENTRAÇÃO
2X concentrado
PROTOCOLO
Apenas para uso in vitro!
Preparação do master mix qPCR
A preparação de um mix principal é crucial em reações de PCR quantitativas para reduzir os erros de pipetagem. Prepare um mix de todos os componentes, exceto o molde, conforme especificado. Um volume de reação de 20-50 µl é recomendado para a maioria dos instrumentos em tempo real. Prepare 13 volumes do mix principal para 12 amostras ou um conjunto triplo de 4 amostras. Pipete com ponteiras de filtro estéreis e minimize a exposição da sonda de DNA marcada à luz. Prepare o ensaio em uma área separada da preparação ou análise do DNA. Controles sem molde devem ser incluídos em todas as amplificações.
| Componente | Reação 20 µL | Reação 50 µL | [ final ] |
| qPCR MultiplexMaster lowROX | 10 µL | 25 µL | 1X |
| Oligonucleotídeo (10 µM) (cada)1 | 0,6 µL | 1,5 µL | 300 nM |
| Sonda duplamente marcada (10 µM) (cada)2 | 0,4 µL | 1,0 µL | 200 nM |
| Molde de DNA | X µL | X µL | <500 ng/reação |
| Água – grau PCR | qsp 20 µL | qsp 50 µL | |
1A concentração final de cada oligonucleotideo pode variar de 100 a 500 nM
2Para otimização dos resultados recomenda-se uma titulação da sonda de DNA entre 50 a 800 nM
Preparando o master mix
Vortexar vigoosamente o master mix para assegurar homogeneidade e dispensar a mistura em tubos de PCR ou na parede de poços de placas de PCR.
Adicionando o molde de DNA
Adicionar o x µL restante a cada tubo contendo o master mix, fechar o tubo ou selar a placa. Não exceder 500 ng de DNA por reação. Os tubos ou placas devem ser centrifugados antes do ciclo para evitar possíveis bolhas.
Condições de termociclagem recomendada
| Denaturação inicial/ Ativação da polimerase |
95 °C | 2 min | 1 X |
| Denaturação | 95 °C | 15 s | 35-45 X |
| Hibridização e Extensão | 60-65 °C 1 | 1 min 2 | |
1A temperatura de hibridização depende da temperatura de melting dos oligos e da sonda utilizados
2O tempo de elongação depende do tamanho dos fragmentos a serem amplificados. O tempo de 1 min para um fragmento de ate 500 bp é recomendado.
Para maior especificidade e amplificação, otimização individual dos parâmetros recomendados pode ser necessária para cada DNA molde, par de oligo e sonda utilizado.
TRANSPORTE E ARMAZENAGEM
Transportado em blue ice
Armazenar à -20 °C. Evite ciclos de congelamento/descongelamento.
Armazenamento à 4 °C é possível por até 3 meses.
DOCUMENTOS
MANUAIS E PROTOCOLOS
qPCR MultiplexMaster with lowROX - Manual (En)
- Neutralization Buffer (adicionar RNAse A antes do uso e armazenar à 4°C);
- RNase A (armazenar à -20°C);
- Activation Buffer;
- Washing Buffer (adicionar Etanol 96-99%, conforme indicação);
- Elution Buffer;
- Binding Columns;
- 2 mL Collection Tubes.
Temperatura ambiente (exceto RNAse – armazenada à -20°C)
Manual 2
Manual 3
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