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qPCR MultiplexMaster with lowROX

Fabricante

Jena Bioscience
Código Nome do Produto Apresentação Preço Qtd Disponibilidade
PCR-322S qPCR MultiplexMaster with lowROX - S Pack 2 x 1.25 ml (2x conc.)
R$2.234,73
Sob encomenda
Entrega: 15-45 dias

PCR-322L qPCR MultiplexMaster with lowROX - L Pack 10 x 1.25 ml (2x conc.)
R$8.938,93
Sob encomenda
Entrega: 15-45 dias

Master mix para real-time PCR multiplex
 

 

Logo Jena Bioscience

qPCR MultiplexMaster with lowROX

qPCR MultiplexMaster com lowROX foi concebido para análises quantitativas em tempo real de amostras de DNA utilizando sondas fluorescentes duplamente marcadas, p. TaqMan®, Beacons Moleculares ou sondas FRET. O master mix é especialmente otimizado para ensaios multiplex com ≥4 sequências-alvo em um único tubo. O sistema supera limitações de multiplex de sondas de qPCR convencionais, combinando uma robustez acima da média para uma multiplicidade de inibidores de PCR conhecidos com uma excelente sensibilidade para amplificação a partir de baixas quantidades de DNA molde. O master mix 2x concentrado contém todos os reagentes necessários para qPCR (exceto molde e conjuntos de oligonucleotídeos/ sondas) incluindo uma polimerase HotStart altamente processiva e dNTPs ultra-puros. O mix proporciona um início por alta temperatura extremamente rigoroso permitindo a montagem da reação e armazenamento temporário à temperatura ambiente antes da PCR. A química da reação do mix é otimizada para instrumentos de PCR de bloco, compatíveis com a avaliação do sinal ROX.

 

Corante de referência ROX

O qPCR MultiplexMaster com lowROX contém corante de referência passivo ROX na concentração final de 500 nM no ensaio. O corante não faz parte da reação de PCR, mas permite normalizar a variação de sinal não relacionada com a PCR e proporciona uma linha de base em reações multiplex.

Propriedades espectroscópicas

Excitação máxima: λex = 576 nm;

Emissão máxima: λem = 601 nm;

 

Sondas de DNA duplamente marcadas

A tecnologia de PCR em tempo real baseada em sondas de DNA duplamente marcada fornece um sistema de PCR altamente sensível e altamente específico com capacidade multiplex. Para a amplificação de cada sequência alvo é necessário um conjunto de dois oligonucleotideos e uma sonda de DNA fluorescente que hibridiza com uma parte interna do amplificado. A sequência da sonda de DNA marcada duplamente deve evitar a formação de estrutura secundária e a formação de dímeros de oligonucleotideos.

 

CONTEÚDO

- qPCR MultiplexMaster com lowROX (tampa vermelha)

(qPCR Pol, dATP, dCTP, dGTP, dUTP, 100 nM ROX, tampão de reação contendo KCl, (NH4)2SO4, MgCl2 e estabilizantes)

- Água grau-PCR (tampa branca)


FORMA

Líquido


CONCENTRAÇÃO

2X concentrado

 

PROTOCOLO

Apenas para uso in vitro!

 

Preparação do master mix qPCR

A preparação de um mix principal é crucial em reações de PCR quantitativas para reduzir os erros de pipetagem. Prepare um mix de todos os componentes, exceto o molde, conforme especificado. Um volume de reação de 20-50 µl é recomendado para a maioria dos instrumentos em tempo real. Prepare 13 volumes do mix principal para 12 amostras ou um conjunto triplo de 4 amostras. Pipete com ponteiras de filtro estéreis e minimize a exposição da sonda de DNA marcada à luz. Prepare o ensaio em uma área separada da preparação ou análise do DNA. Controles sem molde devem ser incluídos em todas as amplificações.

 

Componente Reação 20 µL Reação 50 µL [ final ]
qPCR MultiplexMaster lowROX 10 µL 25 µL 1X
Oligonucleotídeo (10 µM) (cada)1 0,6 µL 1,5 µL 300 nM
Sonda duplamente marcada (10 µM) (cada)2 0,4 µL 1,0 µL 200 nM
Molde de DNA X µL X µL <500 ng/reação
Água – grau PCR qsp 20 µL qsp 50 µL

1A concentração final de cada oligonucleotideo pode variar de 100 a 500 nM

2Para otimização dos resultados recomenda-se uma titulação da sonda de DNA entre 50 a 800 nM

 

Preparando o master mix

Vortexar vigoosamente o master mix para assegurar homogeneidade e dispensar a mistura em tubos de PCR ou na parede de poços de placas de PCR.

 

Adicionando o molde de DNA

Adicionar o x µL restante a cada tubo contendo o master mix, fechar o tubo ou selar a placa. Não exceder 500 ng de DNA por reação. Os tubos ou placas devem ser centrifugados antes do ciclo para evitar possíveis bolhas.

 

Condições de termociclagem recomendada

Denaturação inicial/
Ativação da polimerase
95 °C 2 min 1 X
Denaturação 95 °C 15 s 35-45 X
Hibridização e Extensão 60-65 °C 1 1 min 2

1A temperatura de hibridização depende da temperatura de melting dos oligos e da sonda utilizados

2O tempo de elongação depende do tamanho dos fragmentos a serem amplificados. O tempo de 1 min para um fragmento de ate 500 bp é recomendado.

 

Para maior especificidade e amplificação, otimização individual dos parâmetros recomendados pode ser necessária para cada DNA molde, par de oligo e sonda utilizado.

 

TRANSPORTE E ARMAZENAGEM

Transportado em blue ice

Armazenar à -20 °C. Evite ciclos de congelamento/descongelamento.

Armazenamento à 4 °C é possível por até 3 meses.

 

DOCUMENTOS

MANUAIS E PROTOCOLOS

 qPCR MultiplexMaster with lowROX - Manual (En)

 qPCR MultiplexMaster with lowROX- MSDS (En)

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- Lysis Buffer (com indicador de pH);
- Neutralization Buffer (adicionar RNAse A antes do uso e armazenar à 4°C);
- RNase A (armazenar à -20°C);
- Activation Buffer;
- Washing Buffer (adicionar Etanol 96-99%, conforme indicação);
- Elution Buffer;
- Binding Columns;
- 2 mL Collection Tubes.
Temperatura ambiente
Temperatura ambiente (exceto RNAse – armazenada à -20°C)
Manual 1
Manual 2
Manual 3