qPCR GreenMaster com highROX
qPCR GreenMaster com UNG é projetado para a análise quantitativa em tempo real de amostras de DNA usando o corante de DNA fluorescente EvaGreen®. O corante fluorescente no master mix intercala no produto de amplificação durante o processo de PCR e permite a análise rápida do DNA alvo sem a necessidade de sondas marcadas específicas. Fornece uma ferramenta fácil de manipular e poderosa para a quantificação do DNA na amostra em uma ampla faixa de até 6 ordens de magnitude com excepcional sensibilidade e precisão.
O Master mix contém todos os reagentes necessários para qPCR (exceto molde e oligonucleotideo) em uma solução 2x concentrada pronta para uso. A elevada especificidade e sensibilidade da mistura é devido a uma polimerase hot-start otimizada. Sua atividade é bloqueada à temperatura ambiente e ativada automaticamente no início da desnaturação inicial. A ativação térmica evita a extensão de oligonucleotideos hibridizados inespecificamente e formações de dímero de oligos a baixas temperaturas durante o preparo da reacao de PCR.
O master mix contém UNG (Uracil-N-Glicosilase) e dUTP em vez de dTTP para eliminar o carregamento de contaminação com DNA contendo dU oriundo de reações anteriores. O tratamento com UNG (Uracil-N-Glicosilase) em um passo térmico remove resíduos de uracila de DNA contendo dU e evita que seja utilizado como molde. A química da reação do mix é otimizada para instrumentos de PCR de bloco compatíveis com a avaliação do sinal ROX.
Corante de referência ROX
O qPCR MultiplexMaster com UNG/highROX contém corante de referência passivo ROX na concentração final de 500 nM no ensaio. O corante não faz parte da reação de PCR, mas permite normalizar a variação de sinal não relacionada com a PCR e proporciona uma linha de base em reações multiplex.
Propriedades espectroscópicas
Excitação máxima: λex = 576 nm;
Emissão máxima: λem = 601 nm;
Corante de DNA fluorescente EvaGreen®
Espectros de excitação (esquerda) e emissão (direita) de
EvaGreen® ligado a dsDNA em tampão PBS (pH 7,3)
EvaGreen® Fluorescent DNA Stain é um corante intercalador de DNA superior desenvolvido especialmente para aplicações de análise de DNA, incluindo PCR em tempo real (qPCR) e análise de curva de melting de DNA (HRM) de alta resolução. Ao se ligar ao DNA, o corante nao fluorescente torna-se altamente fluorescente, ao mesmo tempo que nao mostra inibicao detectavel ao processo de PCR. O corante é extremamente estável tanto termicamente como hidroliticamente, proporcionando conveniência durante o manuseio de rotina.
O rendimento quântico elevado, excelente estabilidade e menor inibição em relação à PCR torna o fluoróforo ideal em aplicações de PCR em tempo real e uma substituição superior para o corante SYBR® Green I amplamente utilizado.Para realizar o ensaio baseado em EvaGreen basta selecionar a configuração ótica para SYBR® Green ou FAM no instrumento de detecção.
Propriedades espectroscópicas
Excitação máxima: λex = 500 nm (ligado ao DNA);
Emissão máxima: λem = 530 nm (ligado ao DNA);
CONTEÚDO
- qPCR GreenMaster com UNG/highROX (tampa vermelha)
(qPCR Pol, dATP, dCTP, dGTP, dUTP, EvaGreen®, UNG, 1 µM ROX e tampão de reação contendo KCl, (NH4)2SO4, MgCl2 e estabilizantes)
- Água grau-PCR (tampa branca)
FORMA
Líquido
CONCENTRAÇÃO
2X concentrado
PROTOCOLO
Apenas para uso in vitro!
Preparação do master mix qPCR
A preparação de um mix principal é crucial em reações de PCR quantitativas para reduzir os erros de pipetagem. Prepare um mix de todos os componentes, exceto o molde, conforme especificado. Um volume de reação de 20-50 µl é recomendado para a maioria dos instrumentos em tempo real. Prepare 13 volumes do mix principal para 12 amostras ou um conjunto triplo de 4 amostras. Pipete com ponteiras de filtro estéreis e minimize a exposição da sonda de DNA marcada à luz. Prepare o ensaio em uma área separada da preparação ou análise do DNA. Controles sem molde devem ser incluídos em todas as amplificações.
| Componente | Reação 20 µL | Reação 50 µL | [ final ] |
| qPCR GreenMaster com UNG/highROX | 10 µL | 25 µL | 1X |
| Oligonucleotídeo (10 µM) (cada)1 | 0,6 µL | 1,5 µL | 300 nM |
| Molde de DNA | X µL | X µL | <500 ng/reação |
| Água – grau PCR | qsp 20 µL | qsp 50 µL | |
1A concentração final de cada oligonucleotideo pode variar de 100 a 500 nM
Preparando o master mix
Vortexar vigoosamente o master mix para assegurar homogeneidade e dispensar a mistura em tubos de PCR ou na parede de poços de placas de PCR.
Adicionando o molde de DNA
Adicionar o x µL restante a cada tubo contendo o master mix, fechar o tubo ou selar a placa. Não exceder 500 ng de DNA por reação. Os tubos ou placas devem ser centrifugados antes do ciclo para evitar possíveis bolhas.
Condições de termociclagem recomendada
| Tratamento com UNG1 | 50 °C | 2 min | 1 X |
| Desnaturação inicial/ Ativação da polimerase |
95 °C | 2 min | 1 X |
| Denaturação | 95 °C | 15 s | 35-45 X |
| Hibridização2 | 55-65 °C | 20 s 3 | |
| Extensão3 | 72 °C | 30 s | |
1Passo necessário apenas quando o tratamento com UNG (Uracil-N-Glicosilase) é aplicado
2A temperatura de hibridização depende da temperatura de melting dos oligos e da sonda utilizados
3O tempo de elongação depende do tamanho dos fragmentos a serem amplificados. O tempo de 30 s para um fragmento de ate 500 bp é recomendado.
Para maior especificidade e amplificação, otimização individual dos parâmetros recomendados, especialmente a temperatura de hibridização, pode ser necessária para cada DNA molde e par de oligo.
TRANSPORTE E ARMAZENAGEM
Transportado em blue ice
Armazenar à -20 °C. Evite ciclos de congelamento/descongelamento.
Armazenamento à 4 °C é possível por até 3 meses.
DOCUMENTOS
MANUAIS E PROTOCOLOS
qPCR GreenMaster com UNG/highROX - Manual (En)
- Neutralization Buffer (adicionar RNAse A antes do uso e armazenar à 4°C);
- RNase A (armazenar à -20°C);
- Activation Buffer;
- Washing Buffer (adicionar Etanol 96-99%, conforme indicação);
- Elution Buffer;
- Binding Columns;
- 2 mL Collection Tubes.
Temperatura ambiente (exceto RNAse – armazenada à -20°C)
Manual 2
Manual 3
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