Sítio de restrição
5'- G G C C N N N N ↓ N G G C C - 3'
3'- C C G G N ↑ N N N N C C G G - 5'
FONTE
Streptomyces fimbriatus
DEFINIÇÃO DE UNIDADES
Uma unidade de atividade de endonuclease de restrição é definida como a quantidade de enzima necessária para a completa digestão de 1 µg de Adenovirus-2 DNA (3 sítios) em um volume de 50 µL em 1 hora, nas condições experimentais ótimas.
CONTEÚDO
FORMA
Líquido - 5 mM Tris-HCl pH 7.4, 300 mM NaCl, 5 mM KPO4, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 500 µg/ml BSA, 0.15% Triton X-100 e 50% (v/v) glicerol
Concentração: 10 unidades/µL
Acompanhado de 10X UB (Universal Buffer)
PROTOCOLO
Apenas para uso in vitro!
Ensaio recomendado: 50 µL
| 5 µL | 10X Universal Buffer (UB) |
| 1 µg | DNA1 puro ou produto de PCR2 |
| 5 unidades | enzima selecionada |
| q.s.p 50 µL | Água grau PCR |
1 DNA superespiralado ou DNA alto peso molecular (e.g. DNA genômico de planta) podem requerer tempos de incubação superior ou maior quantidade de enzima
2 Algumas enzimas podem requerem bases adicionais ao sítios de restrição para completa digestão
- O volume de enzima não deve ultrapassar 10% do volume total da reação.
- Adicione a enzima por último. Homogeneizar todos os componentes antes de adicionar a enzima. Após a adição da enzima, homegeneizar por pipetagem. Não utilizar o vortex!
- Incubar 60 min a 50 °C.
- Pare a reação com uma das seguintes alternativas:
- Adição de 2.1 µL de EDTA pH 8.0 [0.5 M], [final] = 20 mM
- Inativação por calor (Não)
- Purificação por Spin Column (e.g. PCR Purification Kit)
- Eletroforose em gel e Excisão de banda única (e.g. Agarose Gel Extraction Kit)
- Extração por clorofórmio ou precipitação por etanol
Digestão Dupla - Compatibilidade de tampões
B1 - 75-100% Atividade relativa
B2 - 100% Atividade relativa
B3 - 25-50% Atividade relativa
B4 - 10-25% Atividade relativa
B5 - 75-100% Atividade relativa
1X UB - 100% Atividade relativa (recomendado)
Por favor, note que a condição ótima para digestão com esta enzima é 1X UB. Com o sistema de tampão universal (UB), a grande maioria das enzimas da Jena Bioscience desempenham 100% da atividade relativa em 1X UB e apenas algumas em 0,5X ou 2X UB. Se as condições ótimas para a segunda enzima forem diferentes das recomendadas para a primeira enzima, sugerimos proceder primeiramente com a reação que emprega a maior concentração de UB, logo após, diluir a reação ajustando a concentração do UB para proceder com a segunda reação de digestão.
Guia de Tampões
| Buffer 1 | [ 10X ] 100 mM Tris-HCl (pH 7.9) 100 mM MgCl2 1000 µg/mL BSA |
| Buffer 2 | [ 10X ] 100 mM Tris-HCl (pH 7.9) 100 mM MgCl2 500 mM NaCl 1000 µg/mL BSA |
| Buffer 3 | [ 10X ] 500 mM Tris-HCl (pH 7.9) 100 mM MgCl2 1000 mM NaCl 1000 µg/mL BSA |
| Buffer 4 | [ 10X ] 100 mM Tris-HCl (pH 7.9) 100 mM MgCl2 1500 mM NaCl 1000 µg/mL BSA |
| Buffer 5 | [ 10X ] 200 mM Tris-acetato (pH 7.9) 100 mM Mg-acetato2 500 mM K-acetato 1000 µg/mL BSA |
Compatibilidade dos Tampões
As enzimas da Jena Bioscience são totalmente compatíveis com sistemas tamponantes e enzimas de restrição de outros fabricantes, e portanto, podem ser empregadas em conjunto em reações de digestão dupla. Para otimizar os resultados, consulte os manuais correspondentes de todos os produtos envolvidos.
Ligação e re-digestão
Após digestão com excesso de 10X com Sfi I, >90% dos fragmentos de DNA podem ser religados e re-digeridos com esta enzima.
Metilação do DNA
Sem Inibição: dam
Inibição (Prejudicada por sobreposição): dcm
Inibição (Bloqueio por combinação de algumas sobreposições): CpG
Controle de qualidade
Todas as enzimas são avaliadas para contaminação endonuclease, 5'exonuclease/5'fosfatase, bem como, atividade de DNase simples e dupla fita não específicas.
TRANSPORTE E ARMAZENAGEM
Transportado em blue ice
Armazenada à -20 °C.
DOCUMENTOS
MANUAIS E PROTOCOLOS
Jena Bioscience - Restriction Enzymes Finder
Jena Bioscience - Restriction Poster
MSDS
- Neutralization Buffer (adicionar RNAse A antes do uso e armazenar à 4°C);
- RNase A (armazenar à -20°C);
- Activation Buffer;
- Washing Buffer (adicionar Etanol 96-99%, conforme indicação);
- Elution Buffer;
- Binding Columns;
- 2 mL Collection Tubes.
Temperatura ambiente (exceto RNAse – armazenada à -20°C)
Manual 2
Manual 3
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