DESCRIÇÃO
Fast-n-Easy Plasmid Mini-Prep Kit
Fast-n-Easy Plasmid Mini-Prep Kit foi desenvolvido para o isolamento de DNA plasmidal ou cosmidial com elevada pureza a partir de células bacterianas, para subsequente amplificação, sequenciamento, digestão por enzimas de restrição ou transformações. O procedimento de dois passos, lise alcalina e ligação em coluna fornecem uma maneira rápida, fácil e eficiente de isolar DNA sem danos e perdas significativas do produto. O sistema permite a eluição em pequena volume de tampão com baixo teor salino. Etapas de extração por fenol-clorofórmio ou precipitação por etanol não são requeridas. O Lysis Buffer contém um indicador de pH integrado que facilita o controle do pH ótimo para ligação. A ligação eficiente do DNA na coluna ocorre com pH 7.5, o que é indicado pela mudança de cor do indicador para a coloração amarelo brilhante. O kit pode ser usado tanto em microcentrífugas quanto em sistema de bomba vácuo. Ele permite a extração de plasmídeos de DNA de até 10 kb e rendimentos de até 20 µg por preparação. O DNA eluído de altíssima qualidade está pronto para uma variedades de aplicações subsequentes.
CONTEÚDOVoltar ao topo
- Lysis Buffer com indicador de pH
- Neutralization Buffer (antes de usar, adicionar RNAse A e armazenar à 4 °C)
- RNase A (armazenar à 20 °C)
- Activation Buffer
- Washing Buffer (antes de usar, adicione 96-99% Etanol conforme indicações do frasco)
- Elution Buffer
- Binding Columns
- Tubos coletores 2 mL
Material adicional
| Buffer |
DPK-104XS 10 preps |
DPK-104S 50 preps |
DPK-104L 250 preps |
| Lysis Buffer | 3.2 mL | 16 mL | 80 mL |
| RNase A | 0.8 mg | 2 x 4 mg | 10 x 4 mg |
| Neutralization Buffer | 3.2 mL adicione 0.8 mg RNAse |
16 mL adicione 1 x 4 mg RNAse |
80 mL adicione 5 x 4 mg RNAse |
| Activation Buffer | 1.2 mL | 6 mL | 30 mL |
| Washing Buffer | Adicione 12 mL Etanol Volume Final: 15 mL |
Adicione 64 mL Etanol Volume Final: 80 mL |
Adicione 160 mL Etanol Volume Final: 200 mL |
| Elution Buffer | 1 mL | 5 mL | 25 mL |
PROTOCOLOVoltar ao topo
Apenas para uso in vitro!
A purificação do DNA acontece por simples procedimento de ligação, lavagem e eluição. A etapa de lavagem opcional (secundária) minimiza o conteúdo salino do produto purificado. Antes de iniciar, adicione os seguintes componentes nos respectivos frascos:
- Adicione RNase A no Neutralization Buffer, conforme indicação na tabela acima e misture bem. O Neutralization Buffer contendo RNAse A deverá ser armazenado à 4 °C.
- A atividade da RNAse A dissolvida no Neutralization Buffer pode diminuir após vários meses e quantidades pequenas de RNA podem ser co-purificadas. Se houver detecção de RNA após a purificação do plasmídeo, adicione a RNAse A remanescente para reestabelcer a atividade.
- Adicione Etanol 96-99% (não incluído no kit) no Washing Buffer conforme indicação do frasco. Note que a concentração do Etanol no Washing Buffer poderá diminuir durante o armazenamento prolongado e uma redução no rendimento de DNA poderá ser observada.
1 Recuperação das células e lise
- Recupere as células a partir de uma cultura celular (1-3 mL) por centrifugação
- Ressuspenda o pellet bacteriano em 300 µL de Lysis Buffer por pipetagem ou vortex - 1 min
2 Neutralização
- Adicione 300 µL do Neutralization Buffer (contendo RNase) na amostra e misture gentilmente por inversão do tubo 4-6 vezes (não vortex!);
- Centrifugue a 10.000 g por 5 min.
- A cor da mistura de ligação deverá mudar para amarelo brilhante, indicando um pH de 7.5 (requerido para a ligação ótimo do DNA na coluna). A coloração laranja ou violeta indica que o pH > 7.5 e implicará numa adsorção do DNA ineficiente. Neste caso, é recomendado o ajuste do pH pela adição de pequeno volume de acetato de sódio 3M (pH 5.0) antes de prosseguir com as demais etapas.
3 Ativação da coluna
- Coloque a spin column em um tubo coletor de 2 mL;
- Adicione 100 µL de Activation Buffer na coluna;
- Centrifugue a 10.000 g por 30 s.
4 Carregamento da coluna
- Aplique o sobrenadante da etapa 2 na coluna ativida por decantação ou pipetagem
- Centrifugue a 10.000 g por 30 s;
- Descarte o que passou pela coluna.
5 Lavagem coluna
- Adicione 500 µL de Washing Buffer na coluna;
- Centrifugue a 10.000 g por 30 s;
- Descarte o que passou pela coluna;
Lavagem Secundária (opcional): Recomendada apenas para fragmentos de DNA menores que 200 bp, se DNA altamente puro (para sequenciamento, transfecção, etc.) for necessário.
- Adicione 700 µL de Washing Buffer na coluna;
- Centrifugue a 10.000 g por 30 s;
- Descarte o que passou pela coluna;
- Centrifugue a 10.000 g por 2 min para remover qualquer resíduo de Washing Buffer.
6 Eluição
- Coloque a coluna em um microtubo de 1.5 mL novo;
- Adicione 30-50 µL de Elution Buffer ou água no centro da coluna;
- Incube por 1 min à temperatura ambiente;
- Centrifugue a 10.000 g por 1 min para eluir o DNA.
TRANSPORTE E ARMAZENAGEMVoltar ao topo
Transportado em temperatura ambiente
Armazenada à temperatura ambiente (exceto RNase (- 20 °C) e Neutralization Buffer após adição da RNAse (4 °C))
DOCUMENTOSVoltar ao topo
MANUAIS E PROTOCOLOS
Fast-n-Easy Plasmid Mini-Prep Kit - Manual (En)
Fast-n-Easy Plasmid Mini-Prep Kit - Manual (Pt)
Fast-n-Easy Plasmid Mini-Prep Kit - MSDS (En)
- Neutralization Buffer (adicionar RNAse A antes do uso e armazenar à 4°C);
- RNase A (armazenar à -20°C);
- Activation Buffer;
- Washing Buffer (adicionar Etanol 96-99%, conforme indicação);
- Elution Buffer;
- Binding Columns;
- 2 mL Collection Tubes.
Temperatura ambiente (exceto RNAse – armazenada à -20°C)
Manual 2
Manual 3
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